美军飞机击落山本五十六的座机（此图根据实际情况而画，已成为美国空军的档案照片）

然而，山本五十六并没有被一时的胜利冲昏头脑。他明白：工业潜力巨大的美国，一旦纳入战争轨道，很快就可以恢复元气。因此，必须迅速彻底地摧毁美国太平洋舰队。于是，山本五十六决定突袭美国海军巡逻机前进基地——中途岛。1942年5月20日，日本海军航空母舰7艘、战列舰11艘、驱逐舰22艘、潜艇21艘，连同后勤舰只在内，总计200余艘，飞机700余架在柱岛集结。这时，美国太平洋舰队所能集结的仅有3艘航空母舰、3艘巡洋舰和14艘驱逐舰。6月初，山本五十六亲率舰只200余艘，分8支特遣舰队向中途岛和阿留申群岛开进。山本的意图是：日军兵分两路，对阿留申群岛实施牵制性攻击，等美军前去侦察或支援时，日军则以主力突然占领中途岛。山本认为，只要取得这次作战的胜利，对美国的战斗意志将是一次更为沉重的打击，有可能将美国的反攻时间推迟到1944年，为日本增强军事经济实力赢得时间。然而，山本五十六的如意算盘打错了。美国海军破译了日军的密码，洞悉其全部作战计划，美国太平洋舰队司令尼米兹采取“设计陷阱，将计就计”

的策略，将3艘舰空母舰隐蔽于中途岛东北200海里的海域，对日本航空母舰编队实施了突然的打击，一举击沉日本大型航空母舰4艘、重型巡洋舰1艘和驱逐舰2艘，击落日本舰载机322架，而美国仅损失航空母舰1艘，飞机147架。这次海战使日军损失了其大型航空母舰的一半和舰载机驾驶员的一半，山本五十六被迫下令停战。　　中途岛之战，山本的自尊心受到了严重的打击。回到日本后，他借口蛔虫作祟腹痛，几天闭门不出。日本对中途岛之战的消息严加保密。为了防止真情外露，生还的官兵全部被遣往南洋作战。